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Para realizarla el paciente debe estar en ayunas las 10 o 16 horas previas a la prueba. Durante ese tiempo sólo podrá beber agua. Después, en la consulta del médico se toma y se analiza una muestra de sangre para obtener una lectura de la línea base. Mientras espera los resultados de la primera prueba, el paciente debe beber "glucola", una bebida con un elevado contenido en azúcar (75 gramos de glucosa). Si la prueba se le realiza a una mujer embarazada se le administrará una dosis mayor de glucosa (100 gramos).

Treinta minutos después de la ingestión de la glucosa, cuando ésta ya se haya trasladado al torrente sanguíneo, se realizará otra extracción: se tomarán muestras de sangre una, dos y tres horas después de beber la glucosa. Estas pruebas se analizarán para ver cómo ha respondido el cuerpo a la glucosa.
Para que los resultados sean fiables la persona que se somete a las pruebas debe estar en buenas condiciones de salud, dado que, desafortunadamente, un simple resfriado o cualquier otra enfermedad podría falsear los resultados. También es imprescindible que la prueba se realice en ayunas, porque un solo café o bien fumar un cigarrillo puede trastocar los niveles del análisis.

Mientras se realiza la prueba oral de tolerancia a la glucosa, el paciente debe estar en reposo, por lo que se recomienda que lea un libro o vea la televisión.
Las extracciones en el plazo de tres horas después de haber bebido la glucola mostrarán el aumento y la disminución de los niveles de azúcar a lo largo del tiempo. Una persona que no padece Diabetes presentará un pico de los niveles de glucosa y, después, estos disminuirán rápidamente. Pero un diabético no será capaz de tolerar la glucosa y sus niveles presentarán un pico. Después irán disminuyendo gradualmente y con mucha más lentitud. Aunque las pruebas muestren niveles altos de Glucemia, la prueba oral de tolerancia a la glucosa deberá realizarse una segunda vez antes de poder emitir un diagnóstico firme de diabetes, con el fin de asegurar que ningún factor externo haya falseado los resultados.